Czy toksyny OP stanowią wyzwanie w neurologii?
Zatrucie związkami fosforoorganicznymi (OP) może prowadzić do stanu padaczkowego (SE), który jest stanem nagłym związanym z wysoką śmiertelnością i istotnymi powikłaniami neurologicznymi. Związki OP mają różnorodne zastosowania, obejmując powszechnie stosowane pestycydy, substancje chemiczne używane w przemyśle oraz dodatki do paliw lotniczych. Do tej kategorii należą również śmiertelne chemiczne środki bojowe. Ekspozycja na OP może nastąpić przypadkowo, w pracy, w domu lub podczas działań wojennych czy terrorystycznych. Niestety, celowe użycie związków OP do samookaleczenia jest również powszechne w krajach rozwijających się.
Związki OP są inhibitorami enzymu acetylocholinesterazy (AChE), co prowadzi do akumulacji acetylocholiny w synapsie. W zależności od dawki OP i poziomu inhibicji AChE, objawy ekspozycji na OP mogą obejmować ślinienie, łzawienie, bóle głowy, drżenia, fascykulacje mięśniowe i drgawki. Objawy te mogą ewoluować w kierunku SE, trudności oddechowych, a ostatecznie śmierci, jeśli nie zostanie udzielona szybka pomoc medyczna. Leczenie ratunkowe zatrucia OP obejmuje wsparcie oddechowe oraz trójlekowy standard opieki (SOC) zalecany przez FDA do opanowania objawów hipercholinergicznych: atropinę (antagonistę receptorów muskarynowych), chlorek pralidoksymu (2-PAM; reaktywator AChE) i midazolam (benzodiazepiną do opanowania drgawek). Te procedury ratunkowe znacznie zmniejszyły ostrą śmiertelność związaną z ekspozycją na OP.
Kluczowe informacje o działaniu VPM w zatruciu OP:
- Werapamil (VPM) wykazuje działanie neuroprotekcyjne po zatruciu związkami fosforoorganicznymi (OP)
- Podanie domięśniowe VPM zapewnia lepszą biodostępność i wyższe stężenia w mózgu niż podanie doustne
- VPM znacząco zmniejsza uszkodzenia neuronów w różnych regionach mózgu po stanie padaczkowym
- Lek jest bezpieczny w podaniu domięśniowym i zachowuje długoterminową stabilność
- Skuteczność neuroprotekcyjna VPM wykazuje pewne różnice międzypłciowe
Czy Werapamil ratuje neurony przed toksycznym działaniem OP?
Uszkodzenie komórkowe i neurodegeneracja są kluczowymi procesami leżącymi u podstaw neurologicznych konsekwencji toksyczności OP. Nasze laboratorium badało mechanizmy homeostazy wapnia neuronalnego w modelach szczurzych toksyczności OP. Odnotowaliśmy przedłużone podwyższenie poziomu wapnia w hipokampie w modelach SE wywołanego paraoksonem i difluorofosforanem diizopropylu (DFP). Stwierdzono, że mechanizmy uwalniania wapnia indukowanego wapniem pośredniczą w tych przewlekłych podwyższeniach poziomu wapnia. Istotnie, leczenie antagonistami receptora rianodyny i inozytolo-tris-fosforanu, takimi jak dantrolen i lewetyracetam, nie tylko obniżało poziom wapnia neuronalnego indukowanego przez OP-SE, ale także wykazywało działanie neuroprotekcyjne. Ketamina, która zapobiega napływowi wapnia poprzez blokowanie receptorów N-metylo-D-asparaginowych, również wykazała działanie neuroprotekcyjne w niektórych modelach OP-SE. Zgłaszano również neurozapalenie w OP-SE, a leczenie farmakologiczne mające na celu tłumienie procesów neurozapalnych jest badane w celu poprawy wyników neurologicznych po zatruciu OP.
Werapamil (VPM) jest blokerem kanału wapniowego z grupy fenyloalkiloamin zatwierdzonym przez FDA w latach 80. do leczenia nadciśnienia tętniczego, a także leczenia dusznicy bolesnej i arytmii serca. Wskazania pozarejestracyjne dla VPM obejmują jego stosowanie w leczeniu klasterowych bólów głowy, ostrego zespołu wieńcowego i skurczu naczyń mózgowych. Lek jest zwykle podawany doustnie, dostępna jest również postać dożylna. Zwykły zakres dawek wynosi 120-360 mg/dzień podawanych doustnie i do 10 mg pozajelitowo. VPM ma długą historię bezpieczeństwa stosowania u ludzi z minimalnymi skutkami ubocznymi i interakcjami lekowymi. Ostatnie odkrycia dotyczące działania molekularnego VPM, oprócz hamowania kanałów wapniowych, wykazały silne działanie neuroprotekcyjne, co rodzi możliwość, że VPM mógłby być również skutecznym lekiem przeciw OP.
W tym badaniu, wykorzystując szczurzy model SE wywołanego przez DFP, porównaliśmy farmakokinetykę VPM podawanego doustnie (p.o.) lub domięśniowo (i.m.). Drogę i.m. wybrano ze względu na konieczność łatwości podawania podczas masowego zatrucia OP. VPM jest również substratem dla P-glikoproteiny (P-gp), białka błonowego, które wyprowadza leki z komórki. Dlatego zmierzyliśmy również poziomy w mózgu zarówno w warunkach SE, jak i bez SE, aby zbadać przenikanie do mózgu i dostępność VPM. Badaliśmy również neuroprotekcyjną skuteczność uzupełniającej terapii i.m. VPM w różnych regionach mózgu po SE wywołanym DFP, gdy podawano go jednocześnie ze standardowym trzylekowym schematem zatwierdzonym przez FDA, składającym się z atropiny, 2-PAM i midazolamu, wskazanym w przypadku zatrucia OP. Oceniano również patologię mięśni w miejscu wstrzyknięcia, aby ocenić bezpieczeństwo powtarzanego podawania i.m. Przeprowadzono również analizę stabilności naszej formulacji VPM.
Aspekty bezpieczeństwa i translacji klinicznej:
- Powtarzane podania domięśniowe VPM nie powodują istotnej patologii mięśni
- Formulacja VPM zachowuje stabilność przez ponad 200 dni
- Dawka 10 mg/kg jest zbliżona do dawek stosowanych u ludzi
- VPM może być wartościowym uzupełnieniem standardowej terapii zatruć OP
- Konieczne są dalsze badania nad długoterminową skutecznością i mechanizmami działania
Jak zaprojektowano badania w modelu SE?
Zgodnie z naszym wcześniej opublikowanym protokołem wywoływania SE indukowanego DFP, osobne kohorty szczurów wstrzykiwano DFP (4 mg/kg, s.c.) lub solą fizjologiczną (0,1 ml/kg). Minutę później wstrzykiwano atropinę (0,5 mg/kg, i.m.) i 2-PAM (25 mg/kg, i.m.), aby umożliwić przeżycie i progresję do SE. Ekspozycja na DFP powodowała objawy postępującej hiperstymulacji cholinergicznej, prowadzącej do ciągłych drgawek (SE). Wykorzystaliśmy kryteria Racine do oceny ciężkości SE. Kryteria behawioralnej skali napadów były następujące: 0 – zatrzymanie zachowania, podnoszenie włosów, pobudzenie i szybki oddech; 1 – ruchy ust/języka, ruchy wibrysów i ślinienie; 2 – kiwanie głową; 3 – klonus przednich kończyn; 4 – kloniczne wspinanie się i 5 – kloniczne wspinanie się z utratą kontroli postawy. Wynik w skali Racine 4-5 był używany jako kryterium oznaczające początek SE, około 5-10 minut po wstrzyknięciu DFP. Godzinę po rozpoczęciu SE podawano midazolam (1,78 mg/kg, i.m.) w celu stłumienia SE.
Szczury, które spełniały kryteria ciężkości SE (Racine 4-5) i otrzymały midazolam 1 godzinę po rozpoczęciu DFP-SE, zostały losowo przydzielone do dwóch grup leczenia: otrzymujących sól fizjologiczną (SAL) lub VPM. Wcześniejsze badania wykazały, że VPM może być podawany dootrzewnowo (i.p.) w modelach drgawek u gryzoni w dawkach do 40 mg/kg. Badanie pilotażowe z dwiema dawkami VPM (10 i 20 mg/kg, i.m.) 1 godzinę po DFP-SE przeprowadzono u szczurów (n = 5). Szczury bezpiecznie tolerowały obie dawki w tych badaniach pilotażowych. Dla tego badania wybraliśmy schemat leczenia 10 mg/kg dwa razy dziennie, ponieważ ta dawka była bliższa dawce równoważnej dla człowieka i pozwalałaby na stabilny poziom w osoczu, biorąc pod uwagę T1/2 wynoszący 5 godzin u ludzi. Tak więc VPM podawano jednocześnie z pierwszą dawką midazolamu 60 minut po rozpoczęciu DFP-SE, a następnie dwa razy dziennie przez 72 godziny, w sumie sześć dawek VPM. Grupa kontrolna otrzymywała iniekcje i.m. SAL przez ten sam czas i z tą samą częstotliwością. Do podawania i.m. VPM lub SAL używano igły 28G, a objętość iniekcji wynosiła 0,1 ml/kg. Miejsca wstrzyknięć były zmieniane między stronami boczną i kontralateralną dla protokołu dawkowania dwa razy dziennie.
W badaniu PK szczury były dawkowane jednorazowo SAL lub VPM (10 mg/kg). Próbki krwi pobierano w duplikatach od 3 do 4 szczurów w każdym z 10 punktów czasowych dla dwóch dróg podawania (i.m. lub p.o.) po podaniu soli fizjologicznej lub DFP. Po znieczuleniu szczury uśmiercano i próbki krwi pobierano przez komory serca w czasie 0, 5 min, 30 min i po 1, 2, 4, 6, 12, 18 i 24 godzinach po podaniu VPM. Krew umieszczano w mikrokuwecie EDTA i zamrażano w temperaturze -80°C do analizy. Jednocześnie z pobieraniem krwi, mózg był szybko rozcinany, korę usuwano i zamrażano w izopentanie (-15°C) i przechowywano w temperaturze -80°C do użycia. Poziomy VPM mierzono w całej krwi i korze za pomocą chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS). Zakres liniowy wynosił 0,05-1200 ng/ml dla VPM.
Jak oceniano uszkodzenia neuronów i bezpieczeństwo iniekcji?
96 godzin po DFP-SE, oddzielna grupa szczurów przeszła procedury perfuzji i utrwalania w celu uzyskania tkanki mózgowej i mięśniowej. Po indukcji głębokiego znieczulenia ketaminą/ksylazyną (75 mg/7,5 mg/kg, i.p.), szczury przeszły perfuzję przezskórną izotoniczną solanką. Następnie perfundowano je 250 ml 4% paraformaldehydu w 0,1 M buforze fosforanowym (pH 7,4). Mózgi i mięśnie czworogłowe usunięto i pozwolono na dalsze utrwalenie przez 24 godziny w buforowanym 4% paraformaldehydzie w 4°C. Mózgi następnie krioprezerwowano w 30% sacharozie w 0,1 M buforze fosforanowym (pH 7,4) przez 3 dni w 4°C. Mózgi następnie osadzano w OCT przez szybkie zamrażanie w izopentanie (-15°C) i przechowywano w temperaturze -80°C do użycia. Utrwalone po perfuzji mięśnie przenoszono do 70% roztworu etanolu i przetwarzano zgodnie z opisem poniżej.
Do oceny uszkodzeń neuronalnych zastosowano barwienie Fluoro-Jade C (FJC). Koronalne przekroje mózgu przygotowano za pomocą kriostatu Leica CM3050S i przyłączono do szkiełek mikroskopowych, które przechowywano w temperaturze -80°C do użycia. Przekroje o grubości 20 μm zbierano między -1,8 mm a -4,56 mm Bregma, w oparciu o atlas anatomiczny szczura. Przekrojenie obejmuje całą grzbietową formację hipokampa i obejmuje korę somatosensoryczną, wzgórze, ciało migdałowate i korę gruszkowatą. Każdy slajd zawierał przekroje reprezentujące wszystkie grupy eksperymentalne (kontrola dopasowana wiekiem, DFP-SAL, DFP-VPM). Co dwudziesty przekrój przez hipokamp szczura jest wybierany z co najmniej sześciu zwierząt do znakowania i barwienia. Slajdy suszono w komorze z osuszaczem w temperaturze 55°C przez 30 minut przed barwieniem. Slajdy najpierw inkubowano w roztworze 1% NaOH w 80% etanolu przez 5 minut, a następnie uwadniano w 70% etanolu, a następnie w ddH₂O przez 2 minuty każdy. Slajdy następnie inkubowano w 0,06% roztworze KMnO₄ przez 10 minut, a następnie płukano w ddH₂O przez 2 minuty. Slajdy następnie barwiono w 0,0004% roztworze Fluoro-Jade C (FJC) w 0,1% kwasie octowym przez 20 minut. Barwione slajdy przeszły trzy płukania w ddH₂O przez 2 minuty każde i były następnie suszone w komorze z osuszaczem w temperaturze 55°C przez 30 minut. Barwione slajdy następnie czyszczono ksylenem przez 5 minut i pokrywano szkiełkiem nakrywkowym z środkiem montażowym DPX.
Aby ocenić bezpieczeństwo powtarzanych podań i.m. VPM, przeprowadzono histologię mięśni w miejscu wstrzyknięcia. Próbki mięśni czworogłowych pobierano 1 dzień i 3 miesiące po ostatnim wstrzyknięciu i.m. schematu leczenia VPM. Te punkty czasowe wybrano, aby ocenić, czy powtarzane wstrzyknięcia VPM powodowały jakiekolwiek uszkodzenie mięśni w miejscu wstrzyknięcia, zarówno ostre, jak i przewlekłe. Próbki mięśni osadzano w parafinie i uzyskiwano przekroje o grubości 5 mikronów. Przekroje te następnie barwiono hematoksyliną i eozyną (H&E) do analizy histopatologicznej. Zautomatyzowane barwienie H&E przeprowadzono za pomocą Dako CoverStainer. Do oceny używano standardowej czteropunktowej skali zapalenia, jak opisano w Tabeli 1. Wynik dla każdego miejsca był średnią wyników dla każdego z trzech bloków tkankowych.
Stabilność formulacji VPM (10 mg/ml w sterylnej solance) oceniano zgodnie z wytycznymi ICH QA1 (R2) [Badanie stabilności nowych substancji lekowych i produktów] i zgodnie z monografią USP VPM do wstrzykiwań (USP29-NF24). Formulację VPM przechowywano w szklanych butelkach w temperaturze 25°C ± 2°C i 60 ± 5% wilgotności względnej. W odpowiednich punktach czasowych (Dzień 0, 90, 203) losowo wybierano trzy butelki i oceniano stabilność formulacji VPM.
Jakie są farmakokinetyczne i neurobiologiczne właściwości VPM?
Wyniki naszego badania wykazują, że i.m. VPM może osiągnąć wyższe poziomy we krwi i mózgu oraz szybszą kinetykę w porównaniu z podawaniem p.o. zarówno u samców, jak i samic szczurów. Nasza formulacja VPM miała długi okres przydatności i ulegała niewielkiej degradacji nawet 200 dni po sporządzeniu. Uzupełniający schemat leczenia składający się z i.m. VPM (10 mg/kg) wraz z terapią OP-SE SOC, rozpoczynającą się 1 godzinę po rozpoczęciu DFP-SE i kontynuowaną przez trzy dni, okazał się bezpieczny i nie powodował znaczącej patologii mięśni zarówno w ostrym, jak i przewlekłym okresie. Wreszcie, terapia i.m. VPM znacznie zmniejszyła uszkodzenie neuronów w wielu regionach mózgu po DFP-SE zarówno u samców, jak i samic szczurów.
Bariera krew-mózg (BBB) jest barierą dyfuzyjną, która reguluje substancje wchodzące do mózgu. Ponadto P-glikoproteina (P-gp) jest białkiem transportowym, które chroni mózg, ograniczając przenikanie ksenobiotyków. Te mechanizmy odgrywają rolę w ograniczaniu wejścia i poziomów leków w mózgu. W szczurzym modelu uszkodzenia OUN wywołanego niedokrwieniem, poziom przenikania VPM do mózgu był zależny od przerwania BBB i regulowany przez P-gp. W naszych badaniach, zarówno w warunkach kontrolnych, jak i DFP-SE, VPM był mierzalny w mózgu po podaniu i.m. Wyższe poziomy VPM w mózgu obserwowano zarówno u samców, jak i samic szczurów po DFP-SE w porównaniu z warunkami kontrolnymi. Ogólnie rzecz biorąc, istniała tendencja do większej i szybszej akumulacji VPM w mózgu u samców w porównaniu z samicami, chociaż nie odnotowano istotności statystycznej. Co ciekawe, poziomy VPM utrzymywały się dłużej u samic szczurów niż u samców, zarówno w warunkach DFP-SE, jak i kontrolnych. Te różnice w kinetyce mózgowej VPM mogą częściowo wyjaśniać różnice płciowe obserwowane w neuroprotekcyjnej skuteczności VPM. Może to również uzasadniać optymalizację dawki i częstości podawania między dwiema płciami.
Czy VPM zmniejsza uszkodzenie neuronów po DFP-SE?
Znaczne uszkodzenie neuronów zgłaszano po OP-SE. Regiony mózgu, które wykazują najcięższe uszkodzenia, obejmują regiony hipokampa (CA1, CA3, DG), a także regiony korowe, takie jak kora ciemieniowa i kora gruszkowata, wraz z regionami jądrowymi w ciele migdałowatym i wzgórzu. Uszkodzenie tych krytycznych struktur uszkadza również obwody mózgowe i zaburza funkcjonalność sieci między tymi regionami mózgu. Zgodnie z tymi odkryciami, po DFP-SE odnotowano rozległe uszkodzenie neuronów struktur w układzie limbicznym i obszarach korowych. Zgłaszano specyficzne dla płci i regionalne różnice w podatności na uszkodzenie neuronów po DFP-SE. Na przykład, jedno badanie DFP-SE wykazało, że komórki FJB+ były znacznie wyższe w DG, ale nie w regionie korowym u dorosłych samic szczurów w porównaniu z dorosłymi samcami szczurów. Co ciekawe, młodociane samce szczurów wykazywały większe uszkodzenie komórek we wszystkich regionach mózgu po DFP-SE w porównaniu z młodocianymi samicami szczurów. W naszym badaniu komórki FJC+ były znacznie liczniejsze u samców szczurów w regionach CA1, DG i PC. Natomiast samice szczurów wykazywały większe uszkodzenie neuronów w regionie CA3 po DFP-SE.
Istnieją doniesienia o neuroprotekcyjnym działaniu VPM w eksperymentalnych modelach uszkodzenia mózgu. Na przykład, VPM zwiększał przeżycie neuronów i pamięć w mysim modelu udaru. VPM (20 mg/kg, i.p.) zapobiegał również uszkodzeniu neuronów i ratował pamięć po ciężkiej hipoglikemii u szczurów. VPM (10 mg/kg, i.p.) jest również zgłaszany jako zmniejszający apoptozę w szczurzym modelu uszkodzenia niedokrwienie/reperfuzja. W komórkowym modelu choroby Alzheimera odnotowano destabilizację homeostazy wapnia i zwiększoną ekscytotoksyczność glutaminianu, które zostały złagodzone przez VPM. Podobnie, VPM był neuroprotekcyjny w komórkowym modelu neurotoksyczności dopaminergicznej. VPM ratował również neurony ruchowe poprzez zmniejszenie stresu retikulum endoplazmatycznego w mysim modelu stwardnienia zanikowego bocznego. Razem, te odkrycia dostarczają uzasadnienia dla VPM jako potencjalnej terapii do złagodzenia toksyczności OP-SE.
Nasze wyniki wykazały, że interwencja VPM miała znaczące działanie neuroprotekcyjne w regionach CA1 i PC u obu płci. Jednak VPM był ochronny w regionie DG tylko u samców szczurów. W regionach CA3, VPM zapewniał pewną neuroprotekcję, o czym świadczy niższa liczba komórek FJC+ u obu płci po DFP-SE; jednak nie można było osiągnąć istotności. Warto zauważyć, że samce szczurów wykazywały znacznie wyższe poziomy VPM w mózgu po DFP-SE, ale lek utrzymywał się dłużej u samic. Czy te różnice związane z PK przyczyniają się do różnic związanych z płcią w wynikach uszkodzenia neuronów po DFP-SE, zostanie to zbadane poprzez badania dawki i czasu trwania VPM w przyszłym badaniu. Wykazano, że neurodegeneracja po ostrym zatruciu DFP ewoluuje w czasie i neurodegeneracja utrzymuje się w bardziej opóźnionych punktach czasowych. Barwienie FJC przeprowadzone 96 godzin po zakończeniu DFP-SE demonstruje ostre efekty interwencji VPM na degenerujące neurony. Czy to działanie VPM utrzymuje się przez pewien czas i zapewnia długoterminową neuroprotekcję, będzie interesujące do zbadania w przyszłych badaniach.
Jak bezpieczna i translacyjna jest terapia VPM?
Badaliśmy również patologiczne efekty powtarzanych podań i.m. VPM, przeprowadzając histologię mięśni w miejscu wstrzyknięcia. Nasze badania wykazały, że schemat leczenia i.m. z VPM nie powodował żadnego jawnego zapalenia ani innej patologii w miejscach wstrzyknięcia zarówno w ostrych, jak i przewlekłych punktach czasowych po zakończeniu okresu wstrzyknięć. Nie odnotowano różnic płciowych w patologii mięśni po podaniach i.m. VPM. Podczas gdy kilka skupisk rozproszonych infiltratów wskazujących na łagodne zapalenie odnotowano w ostrych punktach czasowych, wyniki patologii między szczurami DFP leczonymi SAL lub VPM nie różniły się. 3 miesiące po ostatnim wstrzyknięciu VPM, patologia mięśni ujawniła minimalne infiltraty u niektórych szczurów, podczas gdy większość miała wyniki patologii 0, wskazujące na brak zapalenia. Te badania ustalają bezpieczeństwo i.m. VPM i demonstrują, że ta droga podania może być skuteczną metodą dostarczania VPM po SE. Nasza formulacja VPM miała przedłużony okres przydatności i wykazywała niewielką degradację nawet po 200 dniach po sporządzeniu. Stabilność i łatwość sporządzania VPM do podawania i.m. zapewni korzyści dla gromadzenia formulacji VPM na wypadek, gdyby została dalej zoptymalizowana jako środek przeciw OP.
Nasze badanie miało pewne ograniczenia. Po pierwsze, nie ocenialiśmy elektroencefalograficznego SE, a zamiast tego behawioralnie ocenialiśmy ciężkość SE w skali Racine. Wcześniej wykazaliśmy, że szczury wykazujące wynik Racine 4 i wyższy niezawodnie wykazują elektroencefalograficzne wzorce EEG SE. Ponadto inne badania wykazały, że szczury z kohort mieszanych płciowo trzymane w tym samym pomieszczeniu dawały powtarzalną ciężkość SE u obu płci, niezależnie od tego, czy były w grupie telemetrii EEG (chirurgia) czy nie-telemetrii (nie-chirurgia). Tak więc, podczas gdy nasze badanie obejmowało tylko szczury, które miały Racine 4 i większe (to znaczy, wysokie respondery SE), potwierdzenie EEG zapewniłoby bardziej obiektywną stratyfikację dla ciężkości SE. Następnie, wyniki VPM w takich wysokich i niskich responderach SE mogłyby być badane dla lepszego zrozumienia skuteczności terapeutycznej. Po drugie, nie kwantyfikowaliśmy zmian neurozapalnych w tym badaniu. Podczas gdy nasze dane wykazały silne działania neuroprotekcyjne VPM po DFP-SE, neuroprotekcja jest złożonym procesem obejmującym wiele mechanizmów wykraczających poza neurozapalenie. Zmiany neurozapalne są zgłaszane w SE i DFP-SE, podczas gdy VPM jest zgłaszany jako wywierający działania przeciwzapalne w badaniach laboratoryjnych. Czy efekty neuroprotekcyjne odnotowane tutaj są osiągane poprzez odpowiedź przeciwzapalną, będzie krytycznym elementem informacji, aby w pełni zrozumieć ochronne działania VPM w DFP-SE. Podczas gdy brak biomarkerów zapalnych tutaj ogranicza interpretację neuroprotekcyjnego działania VPM, nie unieważnia go całkowicie. Rzeczywiście, celem tego badania było zwalidowanie neuroprotekcyjnej skuteczności formulacji VPM, która mogłaby być bezpiecznie podawana i.m. po rozsądnym opóźnieniu po DFP-SE. W naszym laboratorium trwają badania mające na celu zbadanie przeciwzapalnych efektów VPM i jego podstawowego mechanizmu molekularnego. Po trzecie, podczas gdy nasze badania wykazały korzystne właściwości PK po pojedynczej dawce i.m. VPM, rozszerzona analiza w jeszcze większej próbie i po wielu dawkach VPM mogłaby zaoferować dodatkowe szczegóły na temat profilu PK i.m. VPM po DFP-SE. Po czwarte, wykorzystaliśmy VPM w pojedynczej dawce (10 mg/kg, i.m.). Jak omówiono wcześniej, tę dawkę wybrano jako bliższą stężeniom równoważnym dla człowieka. Czy wyższa dawka VPM lub dłuższy czas trwania terapii VPM poprawiłyby wyniki neuropatologii wywołanej przez SE, zostanie systematycznie ocenione w przyszłych badaniach.
Kliniczna translacja tych odkryć powinna uwzględniać ograniczenia modelu zwierzęcego. Podobnie jak w przypadku przedklinicznych badań na zwierzętach, modele zwierzęce nie w pełni odzwierciedlają złożoność ludzkich chorób. Różnice metaboliczne i fizjologiczne mogą wpływać na to, jak toksyna zaostrza uszkodzenie i jak ochronna terapia u zwierząt może nie mieć skuteczności u ludzi. Badania toksyczności OP mają dodatkową przeszkodę, ponieważ badania kliniczne środków przeciwdziałających środkom nerwowym byłyby nieetyczne. Tak więc, repurposing istniejących leków zatwierdzonych przez FDA i wykazanie skuteczności w badaniach na zwierzętach są krytycznymi krokami w badaniach środków przeciwdziałających środkom nerwowym. Tak więc, efekty zoptymalizowanej terapii VPM na długoterminowe wyniki neuropatologiczne, behawioralne i napadowe zapewnią jasny potencjał translacyjny tej proponowanej terapii opartej na VPM przeciwko toksyczności wywołanej przez OP.
Podsumowując, dane z tego badania demonstrują potencjał repurposingu VPM jako skutecznego uzupełnienia istniejącej farmakologicznej terapii przeciwdziałającej SOC w celu rozszerzenia skuteczności neuroprotekcyjnej i poprawy długoterminowych wyników neurologicznych po zatruciu OP.
Podsumowanie
Badanie koncentrowało się na ocenie skuteczności werapamilu (VPM) jako potencjalnego leku neuroprotekcyjnego w zatruciu związkami fosforoorganicznymi (OP). Wykazano, że podanie domięśniowe VPM skutkuje lepszą biodostępnością i wyższymi stężeniami we krwi i mózgu w porównaniu z podaniem doustnym. Lek znacząco redukował uszkodzenia neuronów w różnych regionach mózgu po stanie padaczkowym wywołanym przez związki OP, przy czym efekt ten obserwowano zarówno u samców, jak i samic szczurów. Stwierdzono pewne różnice międzypłciowe w skuteczności neuroprotekcyjnej, które mogą być związane z odmienną farmakokinetyką leku. VPM okazał się bezpieczny w podaniu domięśniowym, nie powodując istotnej patologii mięśni, a jego formulacja zachowywała stabilność przez długi okres. Badanie sugeruje, że VPM może być wartościowym uzupełnieniem standardowej terapii przeciwko zatruciom OP, poprawiając długoterminowe wyniki neurologiczne.
