Bedakwilina w leczeniu MDR-TB – nowe spojrzenie na mechanizmy oporności

Czy bedakwilina otwiera nowe horyzonty w leczeniu MDR-TB?

Badanie przedstawia kompleksową analizę mechanizmów oporności na bedakwilinę w leczeniu gruźlicy wielolekoopornej (MDR-TB) oraz potencjalnych strategii jej przezwyciężania. Jest to istotny problem kliniczny, gdyż oporność na bedakwilinę – kluczowy składnik nowego, całkowicie doustnego, 6-miesięcznego schematu leczenia MDR-TB – szybko się rozprzestrzenia, pomimo stosunkowo niedawnego wprowadzenia tego leku do terapii w 2012 roku.

Badanie koncentruje się na wyjaśnieniu molekularnych podstaw oporności na bedakwilinę. Autorzy wykazali, że kliniczna oporność na ten lek rzadko wynika z mutacji w jego docelowym miejscu działania (ATP-aza), ale głównie z nadekspresji operonu pompy efflux MmpS5L5, spowodowanej mutacjami inaktywującymi represor transkrypcyjny Rv0678. Pompa MmpS5L5 należy do rodziny białek błonowych MmpL (mycobacterial membrane protein large), które fizjologicznie odpowiadają za eksport sideroforów żelazowych, ale mogą również usuwać z komórki bakteryjnej bedakwilinę i inne strukturalnie oraz funkcjonalnie różne leki.

Jak nadekspresja operonu MmpS5L5 wpływa na skuteczność terapii?

Populacja badana obejmowała szczepy Mycobacterium tuberculosis z mutacjami w genie Rv0678, które wykazywały zmniejszoną wrażliwość na bedakwilinę i jej pochodne. Badacze wykorzystali także szczepy z nokautem genu MmpS5L5 oraz z jego nadekspresją, a także zastosowali technikę CRISPR interference (CRISPRi) do selektywnego wyciszania ekspresji tych genów.

Wyniki badania potwierdziły, że inaktywacja Rv0678 prowadzi do ośmiokrotnego wzrostu minimalnego stężenia hamującego (MIC) bedakwiliny. Podobny efekt zaobserwowano dla pochodnych bedakwiliny – TBAJ-867 i TBAJ-587, które są obecnie w fazie badań klinicznych. Mutanty wykazywały również zmniejszoną wrażliwość na klofazyminę oraz inhibitory DprE1 (PBTZ-169 i OPC-167832). Co istotne, nokaut genu MmpS5L5 zwiększał wrażliwość na bedakwilinę i jej pochodne, potwierdzając rolę tej pompy w naturalnej oporności. Natomiast komplementacja mutanta ∆S5L5 konstruktem ekspresyjnym MmpS5L5 przywracała i nawet zwiększała oporność na badane leki, co wskazuje na bezpośredni związek między poziomem ekspresji pompy a wrażliwością na leki.

Dalsze eksperymenty z wykorzystaniem CRISPRi do wyciszenia ekspresji MmpS5 lub MmpL5 wykazały podobne efekty jak w przypadku nokautu całego operonu MmpS5L5. Zaobserwowano ponad 4-krotny wzrost wrażliwości na bedakwilinę, klofazyminę i TBAJ-876 oraz mniejszy (0-2-krotny) wzrost wrażliwości na inhibitor DprE1 PBTZ-169. Co kluczowe, wyciszenie MmpS5 lub MmpL5 w szczepie z mutacją Rv0678 przywracało wrażliwość na wszystkie testowane leki do poziomu niższego niż w szczepie dzikim, co dowodzi, że nadekspresja MmpS5L5 jest jedyną przyczyną oporności na leki w mutantach Rv0678.

Czy inhibicja pompy MmpS5L5 zrewolucjonizuje strategię leczenia?

Kluczowym odkryciem było potwierdzenie, że werapamil – lek stosowany w kardiologii – skutecznie hamuje aktywność pompy MmpS5L5. W testach szachownicowych wykazano, że werapamil w sposób zależny od dawki zwiększa wrażliwość na bedakwilinę i inne substraty pompy MmpS5L5, zarówno w szczepach dzikich, jak i tych z nadekspresją pompy. Efekt ten był widoczny już przy stężeniach 6-12,5 µM werapamilu w szczepie dzikim, a przy 3-6 µM w szczepach z nadekspresją MmpS5L5. Przy stężeniach 12,5-25 µM werapamilu przywracana była wrażliwość na poziomie szczepu dzikiego. Co więcej, główny metabolit werapamilu – norwerapamil – wykazywał podobną aktywność, co jest istotne klinicznie, ponieważ norwerapamil osiąga wyższe stężenia w osoczu niż związek macierzysty.

W przeciwieństwie do werapamilu, rabeprazol (inhibitor pompy protonowej), który wykazywał silniejsze działanie hamujące wypływ rifampicyny niż werapamil, nie potencjował aktywności bedakwiliny przy żadnym stężeniu do 100 µM, co sugeruje, że werapamil jest bardziej obiecującym lekiem do potencjalnego zastosowania w terapii bedakwiliną.

Badanie obaliło wcześniejsze hipotezy sugerujące, że werapamil hamuje aktywność pompy poprzez zakłócanie siły protonomotorycznej (PMF). Przeprowadzone eksperymenty wykazały, że werapamil nie wpływa znacząco na gradient pH ani na potencjał błonowy w przeciwieństwie do znanych rozsprzęgaczy PMF, takich jak CCCP czy walinomycyna. Wyniki sugerują, że werapamil działa bezpośrednio jako inhibitor pompy MmpS5L5. Badacze przeprowadzili szereg eksperymentów z wykorzystaniem radioaktywnych znaczników i pomiarów zużycia tlenu, które jednoznacznie wykazały, że werapamil nie zaburza PMF ani nie stymuluje zużycia tlenu, co jest charakterystyczne dla związków protonofotycznych.

Jakie kliniczne implikacje mają badania nad werapilam?

Odkrycia te mają istotne implikacje kliniczne. Werapamil, jako tani, dostępny lek o dobrze poznanych właściwościach farmakokinetycznych i profilu bezpieczeństwa, może stanowić obiecującą terapię wspomagającą w leczeniu MDR-TB. Co więcej, werapamil osiąga 40-krotnie wyższe stężenia w tkance płucnej niż we krwi, co zwiększa jego potencjał terapeutyczny w leczeniu gruźlicy. Dodatkowo, werapamil może wpływać na farmakokinetykę bedakwiliny poprzez hamowanie CYP3A4, głównego enzymu przekształcającego bedakwilinę do mniej aktywnego metabolitu M2.

Warto zauważyć, że werapamil jest dostarczany jako mieszanina racemiczna, a dominujący enancjomer R ma znacznie mniejszą aktywność sercową, ale podobne działanie hamujące na P-gp i wypływ rifampicyny jak enancjomer S. Dlatego prawdopodobnie oba enancjomery przyczyniają się do hamowania wypływu MmpS5L5. Badania na zwierzętach wykazały również, że werapamil i norwerapamil hamują wzrost M. tuberculosis w makrofagach nawet przy braku antybiotyków, co dodatkowo zwiększa ich potencjał terapeutyczny.

Badanie sugeruje, że werapamil mógłby być stosowany jako terapia adjuwantowa zarówno w zapobieganiu, jak i leczeniu oporności na bedakwilinę i inne substraty MmpS5L5. Jednocześnie podkreśla pilną potrzebę opracowania silniejszych inhibitorów MmpS5L5 do jednoczesnego podawania w schematach zawierających bedakwilinę.

Podsumowanie

Badanie koncentruje się na analizie mechanizmów oporności na bedakwilinę w leczeniu gruźlicy wielolekoopornej, gdzie główną rolę odgrywa nadekspresja operonu pompy efflux MmpS5L5. Kluczowym odkryciem jest potwierdzenie skuteczności werapamilu w hamowaniu aktywności tej pompy. Wykazano, że werapamil w sposób zależny od dawki zwiększa wrażliwość na bedakwilinę i inne substraty pompy MmpS5L5. Istotne jest, że werapamil osiąga wysokie stężenia w tkance płucnej i może być stosowany jako terapia wspomagająca w leczeniu MDR-TB. Badania potwierdziły również, że norwerapamil, główny metabolit werapamilu, wykazuje podobną skuteczność. Wyniki sugerują, że werapamil może być skutecznym środkiem w zapobieganiu i leczeniu oporności na bedakwilinę, jednocześnie wskazując na potrzebę opracowania silniejszych inhibitorów MmpS5L5.